Imagerie 3D dynamique du flux sanguin cérébral chez des souris éveillées utilisant soi-même

Communications Biology volume 6, Article number: 298 (2023) Citer cet article

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Le débit sanguin cérébral (CBF) est largement utilisé pour évaluer la fonction cérébrale. Cependant, la plupart des études précliniques CBF ont été réalisées sous anesthésie, ce qui confond les résultats. L'imagerie CBF à haute résolution spatio-temporelle d'animaux éveillés est difficile en raison des artefacts de mouvement et du bruit de fond, en particulier pour l'imagerie de flux basée sur Doppler. Ici, nous rapportons la tomographie Doppler à cohérence optique ultra-haute résolution (µODT) pour l'imagerie 3D de la dynamique de la vitesse CBF (CBFv) chez des souris éveillées en développant un apprentissage en profondeur auto-supervisé pour un débruitage d'image efficace et une suppression des artefacts de mouvement. Nous comparons le CBFv cortical chez des souris éveillées à des souris anesthésiées et leurs réponses dynamiques dans les réseaux artériolaires, veinulaires et capillaires à la cocaïne aiguë (1 mg/kg, iv), une drogue hautement addictive associée à une toxicité neurovasculaire. Comparé à l'éveil, l'isoflurane (2-2,5 %) induit une vasodilatation et augmente le CBFv en 2-4 min, tandis que la dexmédétomidine (0,025 mg/kg, ip) ne modifie ni le diamètre des vaisseaux ni le débit. La cocaïne aiguë diminue le CBFv dans la même mesure dans la dexmédétomidine et les états d'éveil, alors que les diminutions sont plus importantes sous isoflurane, ce qui suggère que la vasodilatation induite par l'isoflurane pourrait avoir facilité la détection de la vasoconstriction induite par la cocaïne. Les souris éveillées après la cocaïne chronique présentent une vasoconstriction sévère, une diminution du CBFv et des adaptations vasculaires avec des vaisseaux artériolaires / veinulaires de plongée prolongés qui donnent la priorité à l'apport sanguin aux capillaires corticaux plus profonds. La plate-forme d'imagerie 3D que nous présentons fournit un outil puissant pour étudier les changements dynamiques des diamètres et de la morphologie des vaisseaux aux côtés des réseaux CBFv dans le cerveau d'animaux éveillés qui peuvent faire progresser notre compréhension des effets des médicaments et des maladies (ischémie, tumeurs, cicatrisation).

Le flux sanguin cérébral (CBF) est crucial pour maintenir l'apport d'énergie nécessaire pour soutenir l'activité synaptique par couplage neurovasculaire. Par conséquent, le CBF ainsi que d'autres mesures hémodynamiques ont été utilisés pour lier les signaux dépendants du niveau d'oxygénation du sang (BOLD) de l'IRM fonctionnelle (IRMf) à l'activité au niveau cellulaire des neurones et des astrocytes1,2. Cependant, les techniques actuelles d'imagerie cérébrovasculaire in vivo d'animaux de laboratoire sont entravées principalement par le compromis entre la profondeur d'imagerie et la résolution spatio-temporelle. Ceux-ci incluent l'IRMf à champ élevé avec une résolution de vaisseau unique jusqu'aux artérioles et aux veinules et une résolution temporelle rapide pour résoudre le volume sanguin cérébral (CBV) et les changements BOLD provoqués par l'activation cérébrale3, la microscopie ultrasonore à base de microbulles pour l'imagerie vasculaire profonde transcrânienne avec une résolution proche de la capillarité et suivi rapide de la vitesse des globules rouges (vRBC)4, et imagerie de fluorescence proche infrarouge à grande longueur d'onde (NIR-II, par exemple, > 1 µm) pour la visualisation de la microvasculature avec une profondeur de pénétration étendue au-delà de 3 mm en fonction de la résolution spatiale et sensibilité5,6. La microscopie photoacoustique (PAM) permet une imagerie microvasculaire sans étiquette 3D des lits capillaires et la cartographie des états d'oxygénation de l'hémoglobine dans ces vaisseaux dans le cortex de souris jusqu'à ~ 0,8 mm de profondeur7. La microscopie à fluorescence multiphotonique est capable d'une superbe résolution spatiale et d'un contraste d'image pour résoudre les réseaux capillaires 3D à une profondeur de 1,6 mm dans le cortex de la souris et de mesurer les vRBC en comptant les globules rouges colorés par fluorescence (flux) circulant dans un capillaire8,9,10. L'angiographie par cohérence optique à ultra haute résolution (µOCA) et la tomographie Doppler (µODT) présentent des avantages pour l'imagerie 3D des réseaux de microvasculature et de vitesse CBF (CBFv) avec une résolution capillaire, plus en détail (par exemple, les réseaux de flux artériolaires, veinulaires et capillaires), et à profondeurs de 1,2 à 1,6 mm à partir de la surface du cortex de la souris11,12,13,14. µODT a également démontré une sensibilité et une résolution pour capturer la réponse du réseau CBFv microcirculatoire à une perturbation laser d'une artériole ou d'un capillaire, et pour détecter la microischémie corticale induite par la cocaïne, la perturbation vasculaire, la néoangiogenèse et l'adaptation, toutes rendues possibles par son champ relativement large de vue et haute résolution spatio-temporelle15,16,17.

L'abus de cocaïne augmente le risque de complications neurologiques potentiellement mortelles, notamment les accidents vasculaires cérébraux, les hémorragies et les accidents ischémiques transitoires. Environ 25 % à 60 % des AVC induits par la cocaïne peuvent être attribués à un vasospasme cérébral et à une ischémie18,19,20,21. La vasoconstriction semble jouer un rôle important parmi les facteurs responsables de l'ischémie19,22,23. En effet, la vasoconstriction cérébrale après provocation aiguë à la cocaïne a été documentée par angiographie chez l'homme22,24. Des études d'imagerie cérébrale ont documenté des diminutions marquées du débit sanguin cérébral (CBF) et du volume sanguin (CBV) chez les cocaïnomanes24,25 et les cerveaux d'animaux26,27. Malgré les avancées des connaissances issues des technologies d'imagerie telles que la TEP et l'IRM concernant les effets de la cocaïne sur la récompense cérébrale, on en sait moins sur les effets aigus et chroniques de la cocaïne sur les réseaux cérébrovasculaires in vivo. Notre µODT 3D mesure l'effet Doppler intrinsèque du déplacement des globules rouges vers l'image CBFv, contournant ainsi le besoin d'agents de contraste. Ceci est hautement souhaitable pour les études d'imagerie longitudinale des expositions à la cocaïne. Notre µODT permet l'imagerie en réseau 3D CBFv à travers les artères, les veines et les capillaires28 et leurs réponses aux activations cérébrales dans différentes couches corticales. 3D µOCA/µODT est : (1) quantitatif, (2) sans étiquette, (3) de sensibilité à haute vitesse (<20 µm/s), (4) de haute résolution spatiale (<6 µm), et (5 ) capables de couvrir rapidement un volume cortical relativement important (par exemple, 3 × 2,4 × 1,5 mm3).

Cependant, la plupart des études précliniques de la microvasculature ont été menées sous anesthésie, ce qui introduit des facteurs de confusion des agents anesthésiques sur les activités cellulaires (par exemple, neuronales, astrocytaires) et l'hémodynamique cérébrale (par exemple, CBF, changements d'oxygénation)29,30,31. De même, la plupart des études sur l'effet de la cocaïne sur le flux sanguin cérébral chez les animaux de laboratoire ont été réalisées sous anesthésie, ce qui pourrait affecter les réponses physiologiques à la cocaïne30,32. Ainsi, des études de neuroimagerie ont commencé à imager des animaux éveillés2,30,33,34,35, ce qui est difficile en raison des artefacts de mouvement qui peuvent compromettre les performances de l'acquisition d'images haute résolution, en particulier pour les techniques d'imagerie de flux basées sur Doppler telles que 3D µOCA. /µODT36,37,38. Pour relever les défis, nous optimisons ici une plate-forme d'imagerie de flux (par exemple, configuration µODT, cage mobile, fenêtre crânienne) qui intègre des méthodes d'apprentissage en profondeur auto-supervisées pour réduire efficacement les artefacts de mouvement des souris éveillées et comparer les différences de 3D microvasculature (µOCA) et réseaux CBFv quantitatifs (µODT) dans le cortex sensorimoteur dans les états éveillés par rapport aux états anesthésiés (par exemple, isoflurane, dexmédétomidine, kétamine). Nous appliquons ces techniques pour mesurer les différences dans les réponses cérébrovasculaires à la cocaïne aiguë entre les conditions éveillées et anesthésiées et pour évaluer les effets de l'exposition chronique à la cocaïne lorsqu'ils sont mesurés chez des souris éveillées.

Pour les modalités de détection de flux basées sur Doppler, l'imagerie haute résolution de la microvascularisation cérébrale et des réseaux CBFv est très sensible au bruit et aux artefacts induits par le mouvement. Contrairement aux études d'imagerie in vivo antérieures sur des animaux anesthésiés, μOCA et μODT 3D d'animaux éveillés sont très difficiles. Pour relever le défi, nous avons mis en place une stratégie combinant l'optimisation de la plate-forme OCT et l'apprentissage auto-supervisé pour un débruitage efficace et une suppression des artefacts de mouvement. L'optimisation de la plate-forme OCT comprend (1) l'optimisation du taux et des points de balayage A pour donner la priorité au taux d'imagerie rapide tout en maintenant une sensibilité suffisante pour la détection du flux capillaire, (2) la miniaturisation de la sonde pour minimiser le bruit des vibrations et (3) la réduction du mouvement de l'animal à l'aide d'un short personnalisé, rigide supports (par exemple, plaque de tête en Ti, cage en carbone flottant à l'air, pré-entraînement sur tapis roulant pour animaux). La figure 1 compare deux groupes d'images représentatives µOCA/µODT dans le cortex sensorimoteur de souris éveillées avant et après la refonte de la tête d'analyse OCT et la formation des animaux. Les panneaux de gauche, acquis avec notre scanner OCT pour des études sur des animaux anesthésiés13, montrent de graves rayures induites par le mouvement, comme le soulignent les flèches jaunes et le bruit général élevé et le flou de la microvasculature dans l'image µOCA (a), et les artefacts de mouvement (flèches bleu clair) et excessif bruit de fond dans l'image µODT (c); alors qu'après la refonte de la tête d'analyse OCT et l'entraînement sur tapis roulant des animaux, les panneaux de droite montrent des artefacts de mouvement de type bande considérablement réduits, un flou et un bruit de fond dans l'image µOCA (b) et une image µODT haute fidélité (d) comparables à celles des animaux anesthésiés17. Les vidéos supplémentaires SV1 et SV2 montrent la différence de mouvements avant et après l'entraînement sur tapis roulant chez une souris à tête retenue. La souris non entraînée était très active avec des mouvements fréquents tout au long de la session, alors qu'après l'entraînement, elle est devenue plus calme et avait beaucoup moins de mouvements qu'avant l'entraînement. Fait intéressant, même si l'imagerie µODT des réseaux CBFv capillaires est généralement plus sujette au bruit de phase induit par le mouvement, la figure 1 montre que les effets de mouvement (par exemple, des artefacts et du bruit en forme de bande) étaient plus profonds sur µOCA que sur µODT chez les animaux éveillés. Cela est probablement dû à la durée plus courte entre 2 A-scans adjacents pour reconstruire µODT (par exemple, ΔtµODT ≈ 2,3 ms) qu'entre deux B-scans adjacents pour reconstruire µOCA (par exemple, ΔtµOCA ≈ 0,21 s). La plus longue durée d'acquisition µOCA (ΔtµOCA ≈ 100ΔtµODT) a entraîné une dégradation plus sévère de l'image induite par le mouvement. En outre, comme les images µODT ne sont pas corrigées en angle (c'est-à-dire l'angle cosinus entre l'incidence de la lumière et la direction du flux) comme sur les Fig. 1c, d, certains flux de branche peuvent apparaître inhomogènes le long du système vasculaire28. Des analyses plus détaillées sont fournies dans la note complémentaire S1.

Panneaux de gauche : images μOCA (a) et μODT (c) acquises avec un scanner OCT précédemment signalé ; panneaux de droite : contreparties acquises avec un scanner OCT repensé après l'entraînement des animaux (b, d). Les flèches jaunes et bleu clair pointent vers des artefacts de mouvement dans les images μOCA et μODT, respectivement. Taille de l'image : 2,3 × 1,2 × 2 mm3.

Comme le montre la figure 1, le bruit de phase induit par le mouvement et les artefacts posent un défi majeur pour l'imagerie neurovasculaire animale éveillée, en particulier pour µOCA. En plus de l'optimisation de la tête de balayage OCT et de la formation d'animaux éveillés, nous avons mis en œuvre diverses méthodes de traitement d'image, y compris la modélisation d'apprentissage en profondeur39,40,41, et développé un modèle d'apprentissage auto-supervisé pour minimiser les artefacts de mouvement et débruiter les images µOCA et µOCA (voir Méthodes pour les cadres détaillés). La figure 2 illustre les résultats du traitement d'image basé sur l'apprentissage en profondeur pour réduire les artefacts induits par le mouvement (par exemple, les rayures et le flou associé des microvaisseaux), dans lequel la figure 2a est l'image MIP projetée à partir de l'ensemble de données brutes µOCA et la figure 2b. est le masque de vaisseau binarisé dérivé de la Fig. 2a par segmentation d'apprentissage en profondeur. La figure 2c est l'image µOCA améliorée en masquant la figure 2a avec la figure 2b, qui montre un bruit de fond considérablement réduit et une restauration claire des réseaux microvasculaires. L'efficacité de notre cadre d'apprentissage en profondeur est évidente par l'élimination de tous les artefacts de type bande (surlignés par des flèches jaunes). Les panneaux inférieurs (Fig. 2d, e) comparent les images μODT avant et après le débruitage du fond de bruit de phase induit par le mouvement. Les résultats de la Fig. 2 indiquent que le traitement d'image basé sur l'apprentissage en profondeur minimise le bruit induit par le mouvement et les artefacts d'animaux éveillés, permettant ainsi une caractérisation quantitative plus précise des réseaux microvasculaires et des changements de CBFv.

Les flèches jaunes (a) pointent vers les artefacts de mouvement dans μOCA qui ont été supprimés par le traitement d'image basé sur l'apprentissage en profondeur (c), où le masque de vaisseau (b) a été dérivé de l'apprentissage auto-supervisé pour l'élimination des artefacts de mouvement. Les panneaux inférieurs montrent que l'image μODT brute (d) a été efficacement débruitée (e) par apprentissage auto-supervisé. Taille d'image 2,3 × 1,2 × 2 mm3.

En raison des défis techniques (par exemple, les artefacts de mouvement), la plupart des études d'imagerie cérébrale in vivo ont été réalisées sur des animaux anesthésiés. Cependant, les effets anesthésiques confondent les réponses fonctionnelles cérébrales aux stimulations électriques ou pharmacologiques et les changements vasculaires cérébraux associés. En effet, une comparaison visuelle des vaisseaux ramifiés correspondants (barres rouges/bleues : vaisseaux artériolaires/veinulaires) sur la Fig. 3 montre une vasodilatation induite par l'isoflurane (Iso). Les analyses statistiques de la Fig. 3e indiquent que les diamètres des vaisseaux ont augmenté de 44,6 % ± 4,2 % (p* < 0,001, m = 8 vaisseaux) dans les artérioles et de 28,2 % ± 5,0 % (p* < 0,001, m = 8) dans les veinules grâce à la densité capillaire est resté inchangé (−0,5 % ± 0,4 %, p = 0,3, m = 8). En plus de la vasodilatation, la Fig. 4 montre la μODT 3D des réseaux CBFv dans les états éveillés (a) vs Iso (b) et leur image de rapport (c) ΔμODT = [μODT(b)-μODT(a)]/μODT(a) pour illustrer les augmentations de CBFv induites par l'isoflurane, dans lesquelles les couleurs rouge et bleue se réfèrent respectivement aux augmentations et aux diminutions de CBFv. Pour suivre la dynamique du flux lors de la transition de l'état éveillé à l'état iso-anesthésié, un panneau plus petit de 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3 mis en évidence par une boîte bleue en pointillés sur la figure 4a a été sélectionné pour acquérir des piles μODT 3D en accéléré (~ 2 min/ cube) comme le montre la Fig. 4d et les images de rapport de la Fig. 4e ont montré des augmentations globales du CBFv sauf dans deux arcades artérielles, c'est-à-dire 2 flèches jaunes sur la Fig. 4a. Sur la base des 16 vaisseaux sélectionnés, la Fig. 4f trace les changements de débit ΔCBFv (t) dans les vaisseaux individuels (traces en pointillés) et leurs changements moyens, par exemple, des traces solides rouges, bleues et vertes pour les flux artériolaires, veinulaires et capillaires. La trace noire en gras représente les changements de débit globaux qui ont augmenté après l'inhalation d'isoflurane à t = 0 min et ont atteint un plateau à t ≈ 4 min (par exemple, augmentation de 50 % ± 12,9 % ; p = 0,0003, m = 16). Le flux artériolaire (FA) et le flux veinulaire (VF) ont augmenté de plus de 70 % (FA : 70,9 % ± 23,1 %, p = 0,02 ; VF : 72,0 % ± 20,9 %, p = 0,01) ; puis la FA est restée relativement stable (par exemple, 57,8 % ± 24,6 %, p = 0,05, m = 6), mais la VF a progressivement diminué jusqu'à 22,6 % ± 10,56 % (p = 0,03, m = 4). Les changements de flux capillaire (CF) étaient plus diversifiés, avec des augmentations supérieures à 150 % et des diminutions supérieures à -82 %, ce qui donne une augmentation totale de 29,5 % ± 22,8 % (p = 0,004, m = 6). La quantification sur les animaux est incluse dans la Fig. 4g, indiquant que le ΔCBF moyen a augmenté de 32,75 % ± 5,65 % après l'induction à l'isoflurane (t = 20–30 min, ROI = 8/animal, n = 7 souris), ce qui est supérieur à la ligne de base normalisée (0,01 % ± 6,35 %, t = −6–0 min ; p* = 0,02) à l'état éveillé.

a, b Images μOCA brutes des états éveillé vs Iso ; c, d leurs images μOCA améliorées correspondantes par traitement d'apprentissage en profondeur ; e analyses statistiques de la vasodilatation induite par l'isoflurane dans les vaisseaux artériolaires (AV), les vaisseaux veinulaires (VV) et la densité capillaire (CD). Taille d'image : 2,3 × 1,2 × 2,5 mm3. Les barres rouges et bleues représentent les changements de taille des vaisseaux artériolaires et veinulaires (Δ\({{{{{\rm{\phi }}}}}}\)), la barre verte représente le changement de densité capillaire (ΔD) dû à Iso.

a, b Images μODT brutes des états éveillé vs Iso et leur image de rapport. c Taille d'image : 2,3 × 2,5 × 1,2 mm3) ; d, e images time-lapse μODT(t) et changements de rapport ΔμODT de l'état éveillé à l'anesthésie Iso (taille de l'image : 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3) ; f CBFv iso-induit augmente ; ga comparaison du ΔCBFv moyen entre l'état d'éveil (t : −8–0 min) et l'anesthésie iso (t : 20–30 min) entre les animaux (p* = 0,02, m = 8 RoI/animal, n = 7 souris).

De même, nous avons comparé les états anesthésiés éveillés et dexmédétomidine (Dex). Dex est de plus en plus favorisé pour les études fonctionnelles sur le cerveau des animaux en raison de sa faible interférence neurophysiologique rapportée42,43. Contrairement à la vasodilatation observée avec Iso (Fig. 3), les images 3D μOCA de la Fig. 5 n'ont pas révélé de vasodilatation ou de vasoconstriction après induction de Dex (0, 025 mg / kg, ip). Les analyses quantitatives de la Fig. 5c indiquent qu'il n'y a pas eu de changements significatifs dans la taille des vaisseaux, par exemple, vaisseaux artériolaires (AV) : -0,3 % ± 0,7 % (p = 0,67, m = 10), vaisseaux veinulaires (VV) : -0,1 % ± 0,6 % (p = 0,71, m = 16) et densité capillaire (DC) : −0,41 % ± 0,3 % (p = 0,29, m = 5). La figure 6 montre μODT 3D des réseaux CBFv dans les états éveillés (a) vs Dex (b) et leurs images de rapport (c), qui ont révélé des changements de flux mineurs et dispersés, y compris des augmentations et des diminutions des artérioles et des veinules sous anesthésie Dex. Time-lapse 3D μODT et leurs images de rapport sur la Fig. 6d, e montrent les changements de flux dans la transition de l'état éveillé à l'état anesthésié Dex dans la ROI sélectionnée (encadré en pointillés) sur la Fig. 6a. La figure 6f trace les changements de débit relatifs dans les vaisseaux individuels (traces en pointillés, n = 20) et les changements moyens de CBFv pour les compartiments artériolaires, veinulaires et capillaires. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) comparant le changement de débit global induit par Dex (trace noire en gras) n'a révélé aucune différence significative au cours du temps t = 0 min à 36 min (F(15, 288) = [1,26], p = 0,23, n = 6 animaux). Des analyses séparées par type de vaisseau ont montré que le débit artériel diminuait progressivement jusqu'à -10,5 % ± 2,61 % (p = 0,01, n = 6) à t ≥ 9 min ; le débit veinulaire a diminué à −14,8 ± 3,76 % (p = 0,03, n = 5) à t ≥ 16 min alors que les changements de débit capillaire étaient divers, avec des augmentations supérieures à 62 % et des diminutions supérieures à −16 %, ce qui donne une augmentation totale de 6,3 % ± 10,1 % (p = 0,6, n = 8). La quantification sur les animaux de la Fig. 6g n'a révélé aucun changement significatif de ΔCBF entre l'état d'éveil ou de référence (0,01% ± 6,21%, t = −8–0 min) et après l'anesthésie Dex (−10,28% ± 4,98%, t = 20–30 min, ROI = 8/animal, n = 3 animaux, p = 0,24).

a, b Images μOCA brutes des états éveillé vs Dex ; c, d Leurs images μOCA améliorées correspondantes par traitement d'apprentissage en profondeur ; e analyses statistiques des changements de taille induits par Dex dans les vaisseaux artériolaires (AV), les vaisseaux veinulaires (VV) et la densité capillaire (CD). Taille de l'image : 2,3 × 1,2 × 2 mm3. Les barres rouges et bleues représentent les changements de taille des vaisseaux artériolaires et veinulaires (Δϕ) respectivement ; la barre verte représente le changement de densité capillaire (ΔD) avec Dex.

a, b Images μODT brutes des états éveillés vs Dex et leur image de rapport (c, taille d'image : 2,3 × 2 × 1,2 mm3); d, e images accélérées μODT(t) et changements de rapport ΔμODT de l'anesthésie éveillée à l'anesthésie Dex (taille de l'image : 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3) ; f Changements CBFv induits par Dex. FA : flux artériel, VF : flux veinulaire, CF : flux capillaire ; g comparaison du ΔCBFv moyen entre l'état d'éveil (t : -8–0 min) et l'anesthésie Dex (t : 20–30 min) entre les animaux (p = 0,24, m = 8RoIs/animal, n = 3).

De plus, nous avons imagé la transition de l'état éveillé à l'état anesthésié à la kétamine. Les résultats ont montré que l'anesthésie à la kétamine en général provoquait une diminution du CBFv régional. Cependant, sa courte mi-temps a nécessité de multiples injections qui ont entraîné des modifications instables et hétérogènes du CBFv (S3 supplémentaire Fig. s1).

Pour explorer les facteurs de confusion potentiels de l'interaction de différents agents anesthésiques sur les effets de la cocaïne sur les réseaux cérébrovasculaires, nous avons comparé les effets de la cocaïne (1 mg/kg, iv) sur la réponse CBFv dans le cortex somatosensoriel entre les états anesthésiques éveillé et Dex ou Iso (Fig. 7).

Modifications du CBFv induites par la cocaïne dans le cortex sensorimoteur de souris anesthésiées éveillées (a – c) vs Dex (d – f) ou Iso (g – i). Panneaux supérieurs : images μODT 3D accélérées des changements CBFv induits par la cocaïne, μODT(t), les nombres à code couleur montrent les emplacements sélectionnés pour suivre les changements de flux dans les panneaux inférieurs correspondants ; Mi-panneaux : images de rapport de ΔμODT(t), taille d'image : 2,3 × 0,3 × 1,2 mm3/panneau ; Panneaux inférieurs : changements CBFv induits par la cocaïne dans les réseaux de flux artériolaires (AF : rouge), veinulaires (VF : bleu) et capillaires (CF : vert). Les traces de couleur en pointillés sont des changements de flux artériolaires (rouges), veinulaires (bleus) et capillaires (verts) individuels avec la cocaïne.

Pour chaque groupe, une image 3D μODT pleine grandeur (2,3 × 2 × 1,2 mm3) a été acquise, à partir de laquelle un panneau plus étroit (2,3 × 0,3 × 1,2 mm3) a été sélectionné (S4 supplémentaire Fig. S3) pour acquérir la dynamique time-lapse modifications du réseau de flux (~1,2 min/volume) avant et après la cocaïne. Une comparaison des changements de CBFv induits par la cocaïne entre les états éveillé (panneau de gauche) et Dex (panneau central) montre un schéma similaire de diminution globale du débit sous anesthésie Dex de -18,5% ± 4,17% et à l'état éveillé de -24,3% ± 4,76% (p = 1, n = 5 animaux). De plus, les images de rapport (b) ont montré que, probablement en raison d'une activité motrice plus élevée dans le cortex sensorimoteur à l'état éveillé que dans les états anesthésiés, les changements de CBFv étaient plus diversifiés, par exemple, présentant des épisodes de rebonds de débit courts après la cocaïne (t = 0 min) , en particulier dans les flux veineux. Apprentissage auto-supervisé pour le suivi des artefacts de mouvement dans le Supplément S6 Fig. S5 montre une corrélation temporelle entre ces épisodes CBFv transitoires et les mouvements de l'animal. Fait intéressant, sur la base des courbes ΔCBFv(t) (c), les amplitudes quantifiées du rebond veineux à l'état d'éveil (12,01 % ± 0,75 %, à t = 2, 8, 20 min) étaient significativement plus élevées qu'à l'état Dex (4,85 % ± 1,64 %, à t = 9, 18, 23, 27 min ; p = 0,01). En revanche, les diminutions de CBFv induites par la cocaïne avec Iso (panneau de droite) étaient uniformes dans les différents compartiments vasculaires (AF, VF et CF) et plus importantes, c'est-à-dire -33,7 % ± 2,78 % qu'à l'état éveillé (-24,3 % ± 4,76 % ; p = 0,04, n = 5) ou avec Dex (−18,5 % ± 4,17 % ; p = 0,01, n = 5 animaux). Il convient de noter à partir de leurs images basales plein champ (S4 supplémentaire Fig. s3) et de la Fig. 4 que l'isoflurane a dilaté les vaisseaux, ce qui a entraîné une augmentation d'environ 46% du CBFv de base et a facilité la détection de la vasoconstriction déclenchée par la cocaïne.

Les réponses du réseau CBFv à la cocaïne chez les animaux anesthésiés à la kétamine ont montré des changements hétérogènes mais pas significatifs (p = 0, 57, m = 14–16, n = 3 animaux) (S3 supplémentaire Fig. s2).

De plus, nous avons imagé les effets de la cocaïne chronique sur les réseaux cérébrovasculaires d'animaux éveillés (n = 2). La cocaïne était administrée (2 × 1 mg/kg/jour, espacés de 2 à 2,5 h, iv) environ tous les 3,5 jours, c'est-à-dire avec une dose totale fixe de 13 mg/kg de cocaïne accumulée sur 25 à 28 jours. La figure 8 montre les réseaux CBFv 3D dans le cortex sensorimoteur entre la ligne de base (a : jour 0) et après la cocaïne chronique (b : jour 24). La vasoconstriction chronique induite par la cocaïne a montré une réduction globale du CBFv. La quantification a montré une vasoconstriction globale Δϕ (c) de −22,3 % ± 3,1 % (p < 0,001, n = 5) et −25 % ± 13,8 % pour la FA (p < 0,001, n = 5) et −19,8 % ± 4,3 % pour FV (p = 0,01, n = 5 animaux) ; la densité de flux capillaire détectable ΔD a été réduite de -51,7% ± 10% (p <0,001, n = 5) sur la base de l'analyse de la carte du squelette de flux17,44 (S5 supplémentaire Fig. s4). La diminution globale du CBFv (d) était de -37,4 % ± -4,7 % (p = 0,001, n = 5) parmi lesquelles les diminutions de débit étaient de -25,6 % ± 9,3 % (p < 0,002, n = 5), -49,1 % ± 27,3 % (p < 0,04, n = 5) et −37,6 % ± 5,5 % (p < 0,001, n = 5) pour les compartiments artériolaire, veinulaire et capillaire, respectivement. Des analyses d'images 3D détaillées sur la figure 9 ont indiqué que les flux capillaires diminués après la cocaïne chronique se produisaient dans les couches corticales supérieures (0–300 µm) tandis que les couches corticales plus profondes (300–1000 µm) montraient des augmentations de débit. Fait intéressant, contrairement au CBFv, il diminue complètement dans la FA, la VF et la CF après une cocaïne aiguë, comme le montre la Fig. 9b, e, h, des adaptations vasculaires, par exemple une redistribution vasculaire avec des arbres artériolaires et veinulaires étendus dans la Fig. 9c, f, i ont été observées. qui semblaient donner la priorité à l'approvisionnement en sang dans les réseaux capillaires plus profonds après la cocaïne chronique, comme illustré par les 6 flux de plongée sélectionnés. Des résultats supplémentaires sont présentés dans la Fig. s7 supplémentaire S8.

a, b Images 3D μODT (2,3 × 1,2 × 2 mm3) au jour 0 (témoin) et au jour 24 (cocaïne chronique). Les points bleus pleins et les cercles bleus en pointillés montrent les retours sur investissement pour les quantifications de flux AF ou VF et de flux capillaire. c, d Diminution significative de la vasoconstriction et du CBFv résultant d'une exposition chronique à la cocaïne dans les réseaux de flux artériel (AF : rouge), de flux veinulaire (VF : bleu) et de flux capillaire (CF : vert).

a–c Images μODT 3D (2,3 × 2 × 0,3 mm3) dans le cortex supérieur (par exemple, L1-L3) au jour 0 (témoin), au jour 4 (cocaïne aiguë) et au jour 24 (cocaïne chronique), montrant une CBFv capillaire réduite lits et branches étendues de FA et FV dans le cas chronique (c) ; d–f les images 3D μODT correspondantes (2,3 × 2 × 0,7 mm3) dans le cortex plus profond (par exemple, L3-L6 et ci-dessous), montrant une augmentation du CBFv dans les branches AF et VF et les lits capillaires dans les cas chroniques (f) ; Vue latérale g – i des images μODT pour illustrer les flux artériolaires de plongée et les flux veinulaires ascendants s'étendant plus profondément dans les couches corticales inférieures en raison de la redistribution du flux capillaire résultant d'une exposition chronique à la cocaïne. Les flèches bleu clair mettent en évidence les profondeurs étendues des six flux artériolaires de plongée et veinulaires ascendants sélectionnés (i = 1, …, 6). Doses cumulées totales de cocaïne : 3 mg/kg pour les cas aigus et doses cumulées de 13 mg/kg pour les cas chroniques.

La détection de phase basée sur Doppler est sujette au bruit de mouvement ; par conséquent, l'imagerie 3D haute résolution CBF d'animaux éveillés reste un défi technique. Dans cette étude, nous avons développé des cadres d'apprentissage en profondeur pour réduire efficacement les artefacts de mouvement et les bruits de phase dans les images 3D µOCA et µODT et démontré l'efficacité de cette méthode pour l'imagerie haute résolution de la microvasculature cérébrale et des réseaux CBFv dans le cortex somatosensoriel du comportement éveillé. souris. L'innovation de cette étude comprend : (1) une méthode d'apprentissage en profondeur auto-supervisée développée et mise en œuvre (voir Méthodes), qui offre des avantages majeurs par rapport aux méthodes supervisées antérieures et est adaptée à l'adaptabilité aux systèmes ODT/OCA génériques et à différentes conditions physiologiques, y compris l'éveil imagerie; (2) rapport sur les réseaux CBFv 3D haute fidélité (avec µODT) et leurs changements dynamiques chez les animaux éveillés ; (3) comparaisons du suivi quantitatif 3D de la dynamique détaillée du réseau microvasculaire à travers les flux artériels, veinulaires et capillaires chez les animaux éveillés par rapport aux animaux anesthésiés et en réponse à la cocaïne aiguë ; (4) la documentation des adaptations vasculaires suite à la cocaïne chronique (par exemple, un débit global réduit dans le cortex avec des augmentations prioritaires du débit capillaire dans le cortex profond) chez des souris éveillées.

Comme l'apprentissage auto-supervisé contourne le besoin de grands ensembles de données en tant que « vérités de terrain » pour la formation, il est particulièrement adapté au débruitage et à la suppression des artefacts de mouvement dans les images µOCA/µODT qui sont généralement peu pratiques à acquérir et sujettes aux changements du système et aux variabilités de la physiologie animale. , notamment pour les études chez l'animal éveillé. Par exemple, les résultats montrent que bien que notre apprentissage supervisé antérieur ait bien fonctionné pour notre ancienne plateforme OCT chez l'animal anesthésié39, il n'a pas été en mesure de restaurer les réseaux capillaires corticaux chez l'animal éveillé alors que le nouvel apprentissage auto-supervisé a réussi (S7 supplémentaire Fig. s6) . Il permet une imagerie µODT haute fidélité du réseau CBFv 3D et de leurs changements dynamiques dans le cortex d'un animal éveillé. Cela fournit un nouvel outil pour étudier la fonction cérébrale basée sur les changements du réseau CBFv chez les animaux éveillés en évitant les confusions et les complications de l'anesthésie. Bien que d'autres études similaires d'imagerie vasculaire animale éveillée aient été rapportées45,46,47,48, elles ont été appliquées pour améliorer l'OCA (angiographie OCT). Notre approche d'apprentissage en profondeur est auto-supervisée non seulement pour supprimer les artefacts de mouvement en vrac dans les images μOCA, mais également pour débruiter les images 3D μODT chez les animaux éveillés. En combinaison avec l'optimisation de la sonde OCT et l'entraînement sur tapis roulant des animaux, il a considérablement amélioré la fidélité de l'image, comme illustré sur les Fig. 1 et 2. Il est intéressant de noter que µOCA était plus sensible aux artefacts de mouvement que µODT en raison de son temps d'acquisition plus long utilisé pour la reconstruction d'image (Note complémentaire S1). Il convient également de noter que la détectabilité de μODT, en particulier pour les flux capillaires minuscules, est extrêmement sensible au bruit de fond du micromouvement des animaux éveillés. Par conséquent, un débruitage supervisé est nécessaire pour améliorer les flux capillaires (Figs. 2 et 4). De grands artefacts de mouvement en vrac peuvent également se produire lors de l'imagerie μODT d'animaux éveillés et peuvent être minimisés par notre algorithme de débruitage basé sur l'apprentissage auto-supervisé (par exemple, Fig. 7a). En raison des artefacts de mouvement et du bruit de phase Doppler (lavage) indépendamment de l'utilisation d'appuie-tête (par exemple, Fig. 1), il est techniquement très difficile d'obtenir une imagerie de flux d'animaux éveillés pour une modalité basée sur Doppler. En effet, nos résultats démontrent une imagerie CBFv 3D haute fidélité (pas d'angiographie ni d'imagerie vasculaire) d'un animal éveillé à l'aide de µODT.

Les images μODT présentaient généralement plusieurs points lumineux (haut débit) et sombres (faible débit), même le long des mêmes vaisseaux. Ces points lumineux et sombres étaient largement reproductibles, tels que ceux de la Fig. 9a, b acquis à des moments différents, ce qui suggère qu'il est peu probable que des globules rouges aléatoires traversent les coupes transversales des vaisseaux dans les B-scans μODT. Au lieu de cela, comme les images μODT présentées n'ont pas été corrigées de l'angle Doppler θz (Note complémentaire S1 pour plus de détails), cela est probablement la cause d'artefacts tels que des points lumineux et sombres le long des flux. Nous avons rapporté une matrice hessienne 3D pour suivre l'angle θz des navires, ce qui permet une correction d'angle précise pour la quantification absolue du CBFv, sauf pour les flux quasi horizontaux (par exemple, 1/cos(θz)→∞, quand θz→900)28.

Les effets des anesthésiques couramment utilisés (par exemple, Iso, Dex) sur la vascularisation cérébrale et l'hémodynamique dans le cortex de la souris ont été mesurés lors de la transition de l'état éveillé à l'état anesthésié. Bien que les effets des agents anesthésiques tels que Iso et Dex sur le système vasculaire cérébral soient généralement connus; nous avons montré ici que les nouvelles avancées en µOCA/µODT nous permettaient de fournir une caractérisation plus détaillée, y compris comment les composants artériels, veinulaires et capillaires étaient affectés par Iso et Dex, à quelle vitesse ils réagissaient, à quel point ils devenaient stables/instables et comment ils ont influencé les réponses vasculaires et hémodynamiques à la cocaïne aiguë. La nouvelle avancée nous a également permis d'évaluer les changements de réseau de flux dans les couches corticales profondes et superficielles avec de la cocaïne chronique. Ces résultats sont pertinents car de nombreuses études fonctionnelles cérébrales précliniques ont été et peuvent encore être réalisées sous anesthésie. À cet égard, nos résultats soutiennent l'utilisation de Dex comme anesthésique pour étudier les effets cérébrovasculaires de la cocaïne qui imitent le mieux l'état d'éveil.

Il convient de noter que le µODT 3D peut combler le fossé entre la TPM (résolution spatiale supérieure, mesure précise du débit, mais limitée à un seul ou à très peu de vaisseaux à la fois) et d'autres modalités mésoscopiques telles que l'imagerie laser speckle qui est rapide mais manque de résolution capillaire et les informations de profondeur. Nos études montrent la valeur unique de µODT pour l'étude des interactions neurovasculaires à haute résolution spatio-temporelle, et sensibilité et à travers différentes couches corticales qui évitent la quantification biaisée des réponses de flux capillaire car les flux capillaires individuels sont très divers ; par conséquent, la capacité de suivre les changements de flux capillaires locaux abondants est cruciale. Par exemple, nos études antérieures et d'autres ont démontré que l'anesthésie Iso déprimait les activités neuronales et dilatait les vaisseaux cérébraux entraînant une augmentation du CBFv19,38,39,40. En effet, nous montrons ici une vasodilatation spectaculaire dans les vaisseaux artériolaires et veinulaires, mais aucun changement dans la densité capillaire alors que le CBFv augmente bien que les changements dans les capillaires individuels soient divers. En revanche, avec l'anesthésie Dex, il n'y avait pas de vasoconstriction détectable et seulement une diminution globale mineure du CBFv. Dans nos études antérieures, nous avons signalé des efforts importants d'Iso mais pas de Dex sur les activités neuronales et astrocytes et CBFv20. Nos résultats actuels fournissent une preuve supplémentaire que les études fonctionnelles cérébrales menées sous Dex sont moins susceptibles d'être confondues par les effets anesthésiques qu'avec l'isoflurane31. Nous avons également évalué l'anesthésie à la kétamine (kétamine/xylazine (87,5 mg/kg/12,5 mg/kg cocktail, ip) qui, parmi plusieurs cibles, agit comme antagoniste du récepteur de l'acide N-méthyl-d-aspartique (NMDA) (NMDAR)49,50. ont montré une diminution du CBFv régional par rapport à l'état d'éveil et observé des réseaux cérébrovasculaires très instables, ce qui pourrait refléter les effets de doses multiples de kétamine nécessaires pour maintenir l'anesthésie (S3 supplémentaire).En outre, dans la mesure où la kétamine augmente la signalisation de la dopamine dans le cerveau, cela ajoute un autre confondre lors de la conduite d'études avec de la cocaïne ou avec d'autres drogues stimulantes.

Pour évaluer les facteurs de confusion de l'anesthésie lors de l'évaluation des effets des agents pharmacologiques dans les réseaux cérébrovasculaires, nous avons sélectionné la cocaïne car il s'agit non seulement d'une drogue très addictive, mais aussi d'une drogue hautement neurotoxique due en grande partie à ses effets cérébrovasculaires qui contribuent à la morbidité et à la mortalité. En fait, la mortalité due à l'abus de cocaïne a considérablement augmenté aux États-Unis avec environ 24 538 décès en 2021. L'étude de modèles précliniques de cocaïne avec des outils d'imagerie in vivo est cliniquement pertinente pour caractériser les mécanismes sous-jacents aux effets vasoconstricteurs de la cocaïne et ainsi aider à développer des interventions. pour les atténuer.

La cocaïne aiguë a réduit le CBFv global dans les réseaux artériels, veinulaires et capillaires chez les souris éveillées et iso- ou Dex-anesthésiées, mais les diminutions étaient plus importantes sous Iso et similaires pour Dex et les états éveillés. Cependant, à l'état éveillé, il y avait plus de courts rebonds (épisodes) dans CBFv, qui étaient probablement associés à des activités motrices induites par la cocaïne dans le cortex sensorimoteur des animaux éveillés. Cela a été corroboré par la corrélation temporelle entre ces épisodes transitoires de CBFv et les mouvements des animaux, tels qu'évalués par l'apprentissage auto-supervisé des algorithmes de suivi des artefacts de mouvement (S6 supplémentaire Fig. s5). Ces résultats indiquent que l'ampleur du CBFv diminue après une cocaïne aiguë sous anesthésie à l'isoflurane, des rapports antérieurs auraient pu être amplifiés par la vasodilatation de l'anesthésique et soulignent l'importance d'effectuer une imagerie chez des animaux éveillés.

Enfin, nous avons évalué les effets de la kétamine sur les effets cérébrovasculaires de la cocaïne. La kétamine, comme la cocaïne, augmente la dopamine dans le cerveau et a d'autres effets fonctionnels cérébraux qui pourraient confondre les études évaluant les effets pharmacologiques de la cocaïne. Plus précisément, (1) il induit des changements dans le CBF régional, les schémas de connectivité interrégionaux et le métabolisme du glutamate51, (2) il altère la disponibilité des transporteurs striataux de la dopamine52, qui sont les cibles des effets de la cocaïne, (3) il inhibe les conséquences neuroendocriniennes et comportementales de l'administration de cocaïne53, et (4) il soutient le renforcement par la désinhibition des neurones dopaminergiques dans la région tegmentale ventrale54. L'analyse quantitative n'a montré aucun changement évident du CBFv après la cocaïne sous anesthésie à la kétamine (Supplémentaire S3).

Des études précliniques antérieures ont documenté les effets neurotoxiques de la cocaïne chronique, y compris la vasoconstriction et l'ischémie16,17,27,55. La plupart de ces études d'imagerie ont été menées sous anesthésie (par exemple, isoflurane), ce qui a probablement confondu les résultats tels que la vasodilatation iso qui aurait pu miner les effets vasoconstricteurs à long terme de la cocaïne. Grâce à la procédure d'implantation de fenêtre crânienne chronique et aux techniques d'artefact de mouvement/de suppression du bruit basées sur l'apprentissage en profondeur, nous sommes désormais en mesure de suivre en détail les changements cérébrovasculaires résultant de l'exposition chronique à la cocaïne chez les animaux éveillés, éliminant ainsi les artefacts confondants induits par l'anesthésie. Nos résultats ont documenté une hypofonction cérébrovasculaire marquée dans le cortex d'animaux éveillés après une exposition chronique à la cocaïne qui pourrait sous-tendre la vulnérabilité à l'ischémie et aux accidents vasculaires cérébraux avec des expositions à la cocaïne, comme l'ont rapporté notre groupe et d'autres17. Nous avons également remarqué sur la base des images µODT 3D (Fig. 8, 9) que la diminution du CBFv capillaire chez les animaux cocaïnomanes chroniques se produisait principalement dans les couches corticales supérieures I à III (par exemple, 0 à 300 µm), tandis que les flux pénétrants artériolaires et veinulaires s'étendaient vers des couches corticales plus profondes (par exemple, 300–780 µm), susceptibles de donner la priorité à la perfusion sanguine dans ces couches vraisemblablement pour maintenir l'activité corticale dans un cerveau globalement hypoperfusé. Les mécanismes sous-jacents à ces réponses différentielles à la cocaïne chronique entre les couches corticales ne sont pas clairs, mais pourraient refléter des différences entre la dopamine et d'autres neurotransmetteurs et récepteurs (par exemple, la noradrénaline) dans la modulation du flux ou de l'activité dans les différentes régions corticales56,57,58. D'autres études sur la vasodynamique et la neurophysiologie associée sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents de ces phénomènes, y compris les changements dans les interactions neuro-astroglio-vasculaires. Il convient de noter que nous avons observé une hypofonction vasculaire cérébrale sévère suite à des doses répétées relativement faibles à modérées de cocaïne (par exemple, une quantité totale de 13 mg/kg de cocaïne sur 25 jours). Par conséquent, il est raisonnable d'anticiper que la neurotoxicité pourrait être beaucoup plus dévastatrice si nous testions un modèle d'auto-administration de cocaïne à accès long pour lequel les animaux administrent jusqu'à 45 mg/kg/jour de cocaïne55.

Une limitation de cette étude était que les changements dans la fonction cellulaire (par exemple, l'activité neuronale et astrocyte) n'étaient pas enregistrés simultanément, ce qui aurait autrement permis de caractériser les différences d'activité neuronale sensorielle et motrice entre les conditions éveillées et anesthésiées. Par conséquent, nous ne pouvons pas séparer les changements attribués à une activité neuronale altérée (par exemple, activités neuronales sensorielles ou motrices) de ceux reflétant des effets cérébrovasculaires directs pour les effets anesthésiques ou leurs interactions avec la cocaïne. Une autre limitation est que, bien que la stabilité physiologique des animaux ait été bien maintenue lors des acquisitions d'images, nous n'avons pas mesuré la profondeur de l'anesthésie. En outre, contrairement à la vasoconstriction ou à la vasodilatation, les effets sur les réseaux capillaires ont été quantifiés en tant que changements de densité capillaire (par exemple, facteur de remplissage).

En résumé, nous avons développé une technique µOCA/µODT innovante et auto-supervisée basée sur l'apprentissage en profondeur et adaptée à l'imagerie cérébrovasculaire 3D haute résolution chez les animaux éveillés. Pour démontrer le potentiel de cette technique pour l'imagerie cérébrale fonctionnelle d'animaux éveillés, nous l'avons appliquée pour documenter les perturbations potentielles de l'anesthésique confond l'hémodynamique cérébrale (CBFv) en réponse à la cocaïne. Les résultats de notre étude documentant les interactions significatives entre les anesthésiques et les effets pharmacologiques de la cocaïne peuvent être cliniquement pertinents. Par exemple, des études précliniques et cliniques ont rapporté que les effets toxiques de la cocaïne sont accentués par l'alcool59, qui a des effets anesthésiques60,61, ainsi la toxicité accrue pourrait refléter de telles interactions. Nos résultats sont également pertinents pour aider à interpréter les études précliniques de neuroimagerie sur la cocaïne menées sous anesthésie et éclairer les études futures pour la sélection d'un agent anesthésique lorsque les études ne peuvent pas être réalisées chez des animaux éveillés. Notre étude contribue également à faire progresser les outils de neuroimagerie, y compris l'utilisation de techniques de traitement d'images améliorées par apprentissage en profondeur qui peuvent être utilisées pour mesurer les effets pharmacologiques des médicaments chez les animaux éveillés et conscients. De plus, en appliquant un apprentissage auto-supervisé avancé, nous sommes en mesure de débruiter et de minimiser efficacement les artefacts de mouvement, et plus important encore, de surveiller le mouvement/mouvement d'un animal éveillé, ce qui est pertinent pour les activités motrices. Cette approche pourrait être utilisée pour étudier la pathologie cérébrovasculaire chronique induite par la cocaïne, par exemple, l'attaque ischémique transitoire et la paralysie associée dans un modèle animal éveillé et ainsi aider à faire progresser notre compréhension de la façon de la prévenir et de la traiter62,63.

Des souris C57BL (Jackson Laboratory) âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées. Un total de 29 souris ont été utilisées pour mener 53 expériences d'imagerie, dans lesquelles 13 souris ont été utilisées dans 26 expériences pour caractériser les différences de débit entre les états anesthésiés et éveillés comme étude de base, et 16 souris ont été utilisées dans 27 expériences pour accéder aux aigus/chroniques effets de la cocaïne sur le flux sanguin cérébral comme exemple de la technologie pour l'étude fonctionnelle du cerveau. Le tableau supplémentaire S2 s1 résume les détails expérimentaux pour les groupes d'animaux afin de comparer les différences de CBFv entre les états anesthésiés et éveillés, et ceux pour étudier les effets de la cocaïne sur les réseaux corticaux de CBFv. Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Stony Brook et menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

Pour implanter une fenêtre crânienne sur le cortex de chaque souris, après anesthésie avec de l'isoflurane par inhalation mélangé à de l'O2 pur (4 % pour l'induction, 1 à 2 % pour l'entretien), la tête de la souris a été fermement fixée sur un cadre stéréotaxique avec une température corporelle maintenue à ~37 °C et une fenêtre crânienne chronique d'environ 3 × 4 mm2 au-dessus de la région du cortex sensorimoteur (A/P −2,0, M/L−2,0) a été soigneusement ouverte. La surface corticale exposée a été immédiatement hydratée avec du gel d'agarose à 2 % et fixée fermement avec une lamelle de verre de 160 μm d'épaisseur en appliquant d'abord de la colle cyanocrylique biocompatible, puis du ciment dentaire (MIA622, HE Parmer Co.) sur les bords de la lamelle pour fixer son fixation avec le crâne, assurant ainsi l'immobilisation du cerveau et minimisant les artefacts de mouvement lors de l'imagerie éveillée. Quatre microvis (MX-0090-01SP, Component Supply Co.) ont été appliquées pour fixer une plaque de tête en métal sur le crâne environnant au-dessus de la fenêtre crânienne et fixées avec du ciment dentaire (MIA622, HE Parmer Co. Inc.). La plaie entourant la fenêtre crânienne a été suturée, stérilisée et la souris a reçu des traitements antibiotiques et anti-inflammatoires (si nécessaire) pour assurer une clairance optique à long terme. L'état physiologique de la souris, y compris l'électrocardiographie (ECG), la fréquence respiratoire et la température corporelle, a été surveillé en continu (SA Instruments, NY) pendant les expériences. Toutes les procédures ont suivi les directives de stérilisation pour la chirurgie de survie.

Une cage mobile personnalisée pour rongeurs gonflée à l'air (tapis roulant) a été utilisée pour entraîner des souris à tête fixe afin de réduire les artefacts de mouvement pour l'imagerie cérébrale d'animaux conscients30. La cage mobile en forme de cylindre (par exemple, ϕ24 mm × 8 mm) constituée d'une feuille de fibre de carbone rigide et ultralégère, flottait à environ 0,8 mm au-dessus d'une table gonflée à l'air (par exemple, ϕ380 mm) pour permettre un mouvement libre dans des directions horizontales arbitraires lorsque une souris a tenté de marcher ou de courir. La cage mobile a créé une illusion de course libre tout en gardant la tête de l'animal immobile pour une imagerie optique sans mouvement de la fonction cérébrale. Cependant, la fixation de la tête induit un stress qui pourrait déclencher des effets de confusion sur les études neurophysiologiques et les micromouvements cérébraux pourraient à leur tour compromettre la détection par imagerie optique. Pour habituer les animaux à la procédure d'imagerie à tête fixe et minimiser les artefacts de mouvement, les animaux ont été entraînés dans les mêmes conditions que celles des séances d'imagerie éveillées. Une formation de trois jours a été adoptée avec de multiples sessions de formation prolongées, au cours desquelles les souris étaient fixées à la tête tout en se tenant debout sur la cage mobile gonflée à l'air, le temps de formation par session augmentant progressivement de 10 min à 30 min et 60 min et les sessions de formation augmentées de 1 session du jour 1 à 3 sessions du jour 3. La zone entourant la tête de la souris a été drapée d'un tissu noir pour minimiser les interférences des stimulations visuelles et audio ambiantes64, et les signes de stress ont été surveillés par l'apparition de vocalisations et de mouvements pendant la formation séances65,66. Les protocoles animaux pour la préparation, la formation et l'imagerie in vivo des animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Stony Brook et ont suivi les directives des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.

L'imagerie 3D in vivo des réseaux de microvasculature et de vitesse du flux sanguin cérébral (CBFv) dans le cortex sensorimoteur de souris anesthésiées ou éveillées a été réalisée sur une configuration personnalisée de tomographie par cohérence optique à ultra haute résolution (μOCT), dans laquelle une source de lumière à ultra large bande (I = 8mw; λ = 1310 nm, ΔλFWHM ≈ 200 nm) a illuminé un interféromètre de Michelson à fibre optique aplati en longueur d'onde 2 × 2, capable d'atteindre une résolution axiale de 2,5 µm dans le tissu biologique (c'est-à-dire, longueur de cohérence Lc = 2(ln2) 1/2/π·λ2/ΔλFWHM). La lumière sortant du bras de l'échantillon a été collimatée à ϕ3–4 mm, balayée transversalement par un servo mineur et focalisée à travers la fenêtre crânienne chronique sur le cortex sensorimoteur de la souris par un doublet achromatique NIR (f18 mm/NA 0,25, Edmond Optics), donnant un résolution latérale maximale de 3,2 µm. La lumière renvoyée par l'échantillon et les bras de référence a été recombinée dans la fibre de détection, collimatée et diffractée linéairement par un spectromètre personnalisé, et détectée par une caméra InGaAs à balayage linéaire de 2k pixels (2048 R, Sensors Unlimited) jusqu'à 147k A-lines/ s. La projection d'intensité maximale (MIP) en face des réseaux CBFv a été instantanément reconstruite via une unité de traitement graphique (GPU) optimisée par une programmation GUI personnalisée pour permettre l'affichage en temps réel des réseaux de flux, par exemple à 2 M pixels par section transversale ou B- numérisez aussi vite que 473fps. Les images 3D des réseaux de microvasculature (µOCA) et CBFv (µODT) dans le cortex de souris ont été reconstruites par analyse de variance de chatoiement et méthode de soustraction de phase, respectivement11,13,15 (Note complémentaire S1 pour plus de détails).

Pour minimiser les artefacts de mouvement critiques pour l'imagerie 3D µOCA/µODT d'animaux éveillés, des modifications du scanner OCT ont été mises en œuvre, notamment le raccourcissement du chemin optique dans le bras de l'échantillon, l'utilisation de mécano-optiques moulées et la conception d'une plaque de transition rigide en Ti qui interconnecte le fenêtre crânienne de souris et la sonde OCT. De plus, les paradigmes d'acquisition d'images ont été optimisés, par exemple en augmentant les balayages B répétés de 4 images à 14 images pour µOCA et en augmentant le taux de balayage A à 8 kHz avec des points de balayage A réduits à 10k pour µODT plein champ afin d'éliminer efficacement le bruit de mouvement par traitement post-image.

Pour passer de l'état éveillé à l'état anesthésié pendant l'imagerie, les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane par inhalation à 2, 0–2, 5% (Iso) ou par injection intrapéritonéale de dexmédétomidine (Dex, 0, 025 mg / kg, ip). Le maintien de l'anesthésie a été confirmé par une absence de réponse à la douleur et des rythmes respiratoires stables (Small Animal Instrumentation, Model 1025 L). La cocaïne a été administrée via des injections dans la veine caudale (1 mg/kg, iv) pour comparer les changements hémodynamiques induits par la cocaïne (par exemple, vasoconstriction ou dilatation, modifications du CBFv) entre les états éveillé et anesthésié (par exemple, Iso, Dex). À titre de comparaison, la kétamine en tant qu'agent anesthésique, contenant un cocktail de 87,5 mg/kg de kétamine et de 12,5 mg/kg de xylazine, a été administrée (ip) pour passer de l'état éveillé à l'état anesthésié pendant l'imagerie, ainsi que pour suivre les changements de CBFv induits par la cocaïne dans le cortex animal. Les procédures expérimentales détaillées sont décrites dans le Supplément S3.

3D μODT et μOCA ont été reconstruits par la méthode de soustraction de phase qui a dérivé la vitesse d'écoulement (décalage de fréquence Doppler ν) à partir de la différence de phase entre 2 A-scans adjacents et en calculant la variance de speckle (c'est-à-dire l'écart-type normalisé) parmi les B-scans adjacents, respectivement (note complémentaire S1). μODT a été utilisé pour discerner les flux artériels et veineux16. En bref, la vitesse d'écoulement Doppler ν est attribuée (+/-) en tant que produit de la direction d'écoulement ou de la différence de phase et de l'angle d'écoulement θz (c'est-à-dire cosθz "+" pour 00-900, "-" pour 900-1800) ; ainsi, en appliquant la matrice hessienne à la piste θz, la direction d'écoulement le long d'un navire peut être déterminée. Si la direction du flux dans un grand arbre vasculaire est vers les branches (par exemple, ramification), il s'agit d'une artère/artériole ; si les directions d'écoulement des branches se rejoignent dans des vaisseaux plus gros (par exemple, en se ramifiant), il s'agit d'une veine/veinule16.

Les artefacts dans µOCA induits par le mouvement en vrac (par exemple, le mouvement des animaux) ont tendance à augmenter les artefacts de mouvement en forme de bande ; par conséquent, la suppression des artefacts de mouvement est essentielle pour permettre une détection précise de la microvascularisation, en particulier pour l'imagerie animale éveillée. Ici, cela a été mis en œuvre par une approche combinée. Comme les artefacts de mouvement entraînent une décorrélation substantielle sur plusieurs B-scans en raison de la dérive instantanée ou de la gigue, des B-scans supplémentaires (par exemple, N = 14) ont été acquis, parmi lesquels les B-scans les plus corrélés (par exemple, N' = 6, rCorr > 0,9) ont été sélectionnés pour reconstruire le B-scan de µOCA via l'algorithme de variance de speckle pour le prétraitement afin de supprimer les artefacts de mouvement (Note complémentaire S1).

Bien que le prétraitement du B-scan ait pu corriger la plupart des artefacts de mouvement résultant d'un mouvement modéré, certains bruits importants et insolubles de type bande provenant d'un mouvement sévère subsistaient, qui s'étendaient souvent sur plusieurs B-scans adjacents (Fig. 2a). Pour supprimer davantage les artefacts de mouvement, une méthode basée sur le gradient, par exemple un flux orienté de manière optimale, a été utilisée pour produire une segmentation binaire initiale des réseaux cérébrovasculaires44,67. Comme les B-scans effondrés par des bruits de type bande étaient perceptibles, ces bandes ont d'abord été supprimées, puis leurs régions ont été récupérées par un modèle efficace d'inpainting sensible à la structure basé sur l'apprentissage en profondeur, qui a été conçu pour remplir les masques de vaisseau dans le éliminé régions de vassalité40,44. Plus précisément, le modèle a intégré les informations de vascularisation en termes de gradients d'image dans la zone de bande d'origine pour guider le processus de récupération, qui a suivi l'architecture décodeur-encodeur avec des modules GatedConv pour l'inpainting41. De telles informations de structure ont apporté des indices supplémentaires qui étaient négligés par les méthodes existantes, et ont ainsi renforcé la robustesse de notre modèle d'inpainting, en particulier pour les larges rayures qui posaient de grands défis à ces méthodes. De plus, les informations de structure dans la zone claire ont été pleinement utilisées pour former notre modèle de manière auto-supervisée, évitant ainsi le besoin d'annotations manuelles coûteuses. Pour plus de détails, un schéma du modèle d'apprentissage auto-supervisé est illustré à la Fig. 10a. Après la génération du masque de vaisseau binarisé sans artefact de mouvement (par exemple, Fig. 2b), il a été multiplié par l'image MIP µOCA d'entrée pour fournir l'image µOCA améliorée afin d'illustrer les réseaux microvasculaires 3D sans artefact de mouvement dans le cerveau de la souris ( ex., figure 2c). Le masque binarisé Fig. 2b a également été utilisé pour calculer la densité de flux capillaire (CD) comme indiqué dans le Supplément S5 Fig. s4.

un organigramme du modèle d'apprentissage en profondeur auto-supervisé pour apprendre les modèles de bruit induits par le mouvement (c'est-à-dire les flèches vertes) et pour réduire efficacement les bruits et les artefacts (par exemple, les flèches rouges). BMA : artefacts de mouvement en vrac ; CNN : réseau de neurones convolutifs. b Organigramme du modèle d'amélioration 3D µODT auto-supervisé pour apprendre les caractéristiques invariantes vasculaires (par exemple, flèche verte) pour supprimer les bruits de fond dans le volume d'origine (par exemple, flèche rouge).

Pendant ce temps, un modèle d'apprentissage auto-supervisé a été dérivé pour améliorer les flux microvasculaires dans les volumes µODT 3D, qui ont appris les caractéristiques vasculaires invariantes des modules Intensity Remapping (IR) et Vessel Cropping (VC). Sur la base des statistiques sur la distribution des données, le module IR a généré des vaisseaux d'intensités différentes pour guider l'apprentissage des caractéristiques d'intensité invariante. De plus, le module VC a été utilisé pour encourager la connectivité vasculaire de la prédiction. Pour être précis, certains segments de vaisseaux ont été abandonnés au hasard pour entraîner le modèle à apprendre les caractéristiques vasculaires via la restauration des segments supprimés ; ainsi, notre modèle a non seulement amélioré le contraste de l'image, mais également amélioré la connectivité des vaisseaux. Comparé à d'autres méthodes auto-supervisées, notre modèle n'a pas besoin de paires d'images claires/bruyantes ou bruyantes/bruyantes, et est donc plus pratique dans les applications biomédicales liées à µODT. Le CNN 3D de style UNet a été utilisé comme épine dorsale, comme illustré à la Fig. 10b. Après la convergence de la formation, notre modèle a converti un volume µODT bruyant directement en un volume µODT efficacement amélioré (par exemple, à partir de la Fig. 2d, e. En plus de supprimer les artefacts de mouvement, la méthode d'auto-formation a efficacement supprimé le bruit de fond et amélioré le contraste de l'image , améliorant les réseaux à faible flux capillaire dans les régions à faible SNR.

Pour quantifier le CBFv et comparer leurs différences, environ 4 à 6 récipients pour chaque type de récipient ont été sélectionnés dans chaque animal pour échantillonner leurs changements de débit et calculer leurs moyennes et erreurs standard, dans lesquelles les points d'échantillonnage (par exemple, i = 1,…, 6) et les traces correspondantes ont été surlignées en rouge, bleu et vert pour les flux artériels, veineux et capillaires, respectivement. Les modifications des réseaux microvasculaires (par exemple, vasodilatation ou vasoconstriction) ont été présentées sous forme de modifications relatives, c'est-à-dire Δϕ=(ϕ–ϕ0)/ϕ0, où ϕ0 fait référence à la taille de base des vaisseaux. De même, les modifications du débit sanguin mesurées par µODT ont été présentées sous la forme ΔCBFv = (CBFv–CBFv0)/CBFv0, où CBFv0 fait référence au débit de base correspondant.

Les tests statistiques ont été réalisés avec le logiciel SYSTAT (Chicago, IL, USA). Les différences de CBFv et de diamètre des vaisseaux entre les états éveillé et anesthésique (par exemple, ISO, DEX) et entre la ligne de base et après l'injection de cocaïne ont été testées par des tests t bilatéraux ou des tests de somme de rang. Les changements de CBFv, la vasoconstriction ou la dilatation ont été testés pour la différence significative en utilisant une ANOVA à mesure répétée unidirectionnelle suivie d'un test post hoc (méthode Holm – Sidak). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et NS signifie non significatif. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± std pour les variations en pourcentage.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Tous les ensembles de données sources présentés dans cette étude sont inclus dans les fichiers de données supplémentaires 1 et 2. Des données supplémentaires, en particulier pour les grandes images 3D brutes, sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Cette recherche a été financée en partie par les subventions 2R01DA029718 (CD, YP) ​​et 1RF1DA048808 (YP, CD) des National Institutes of Health.

Département de génie biomédical, Université Stony Brook, Stony Brook, NY, 11794, États-Unis

Yingtian Pan, parc Kicheon et Congwu Du

Département d'informatique, Université de Stony Brook, Stony Brook, NY, 11794, États-Unis

Jiaxiang Ren et Haibin Ling

National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20857, États-Unis

Nora D. Volkow

Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Alan P. Koretsky

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CD, NDV et YP ont conçu la recherche. KP a réalisé les expériences in vivo et l'analyse des données ; JR et HL ont effectué un traitement d'image basé sur l'apprentissage auto-supervisé (KP et JR ont contribué à parts égales). YP, CD, NVD et AK ont contribué à l'interprétation des données, aux discussions sur les résultats et à la rédaction du manuscrit.

Correspondance avec Yingtian Pan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Chao Zhou et Manuel Breuer. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Pan, Y., Park, K., Ren, J. et al. Imagerie 3D dynamique du flux sanguin cérébral chez des souris éveillées à l'aide d'une tomographie Doppler à cohérence optique auto-supervisée et améliorée par l'apprentissage. Commun Biol 6, 298 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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Reçu : 05 mai 2022

Accepté : 03 mars 2023

Publié: 21 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04656-x

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